|
|
Studium mechanismu opravy mezivláknových křížových vazeb indukovaných alkoholem pomocí nukleasy SLX4-XPF-ERCC1
Havlíková, Jana ; Šilhán, Jan (vedoucí práce) ; Lux, Vanda (oponent)
Alkohol se řadí mezi nejpoužívanější rekreační drogu na světě, přestože se považuje jako rizikový faktor více než 200 nemocí. Hlavní negativní dopad alkoholu spočívá v jeho metabolitu acetaldehydu, který jakožto vysoce reaktivní sloučenina, může mimo jiné s DNA tvořit mutagenní adukty a mezivláknové křížové vazby, neboli ICL (z angl. Interstrand crosslink). Tvorba ICL, jehož kovalentní charakter blokuje oddělení dvou vláken DNA během replikace, je jedna z důležitých příčin mutageneze a karcinogeneze. Pro udržení genomové stability se vyvinuly opravné mechanismy. Jedním z nich je dráha, která využívá proteiny kódované geny Fanconiho anémie (FA), jejichž defekty vedou ke stejnojmennému onemocnění. Defekty opravných drah mohou být zvláště nebezpečné u osob s nedostatečnou funkčností jiných metabolických drah, jež jsou v případě acetaldehydových ICL alkoholici a osoby s mutacemi v genech, v jejichž důsledku dochází k hromadění toxického acetaldehydu. Teoretická část této práce se zabývá metabolismem alkoholu, in vivo tvorbou acetaldehydu a jeho interakcemi s DNA. Blíže jsou charakterizována ICL a jejich opravné dráhy. Samostatná kapitola je věnovaná FA. Praktická část této práce se zabývá přípravou ICL indukovaného acetaldehydem (zkr. AA-ICL) ve specifické pozici DNA a studiem jeho opravy in vitro. Konkrétně je...
|
|
|
Studium regulace a funkce DNA-opravných enzymů UBE2T a FANCL
Hušková, Andrea ; Šilhán, Jan (vedoucí práce) ; Martínková, Markéta (oponent)
DNA podléhá denně až 70 000 různým poškozením, tudíž existence opravných mechanismů a enzymů je více než nezbytná. Již známe základní mechanismy několika specifických opravných drah, z nichž opravná dráha Fanconiho anémie (FA) je jedna z nejméně prozkoumaných. FA je vzácná autosomálně recesivní porucha charakterizovaná selháním kostní dřeně, vývojovými defekty, genomickou nestabilitou a predispozicí k akutní myeloidní leukémii a vzniku nádorů. Primární diagnóza FA je přecitlivělost na činidla způsobující meziřetězcové kovalentní spojení DNA v důsledku deaktivace jednoho z 21 genů, tzv. genů FANC (z angl. FA complementation group), z opravné dráhy FA. Molekulárním defektem ve FA je narušená oprava meziřetězcových kovalentních spojení DNA. Tato spojení jsou vysoce cytotoxická a inhibují proces replikace a transkripce DNA. Rozhodujícím krokem v opravné dráze FA, který iniciuje opravu meziřetězcových spojení DNA, je monoubiquitinylace FANCD2. Ubiquitinylovaný FANCD2 je základem pro svolání dalších proteinů participujících v opravné dráze FA. Ubiquitin je aktivován pomocí ubiquitin- aktivujícího enzymu UBA1 a přenesen prostřednictvím ubiquitin-konjugujícího enzymu UBE2T na FANCD2 multipodjednotkovou E3-ligasou (nukleární komplex FA). Existuje až 11 různých proteinů, které tvoří nukleární komplex FA, z...
|
|
|
Molekulární mechanismus regulace opravné dráhy Fanconiho anémie fosforylací proteinu FANCI
Krejčová, Kateřina ; Šilhán, Jan (vedoucí práce) ; Bárta, František (oponent)
Fanconiho anémie je autosomálně recesivní onemocnění způsobené mutací v jednom z Fanconiho genů. Mezi projevy tohoto onemocnění patří vývojové abnormality, poruchy tvorby kostní dřeně, zvýšená citlivost na činidla způsobující tvorbu meziřetězcových spojení komplementárních vláken DNA predispozice k rakovině a mnoho dalších. Takto vzniklá spojení vláken DNA jsou opravena za pomoci opravné dráhy Fanconiho anémie, která pro správnou funkci vyžaduje monoubiquitinylaci proteinu FANCD2, která je závislá na fosforylaci proteinu FANCI pomocí ATR kinasy. Bylo zjištěno, že fosforylace FANCI spouští tuto opravnou dráhu, ovšem přesný molekulární mechanismus není doposud znám. V této práci byl studován molekulární mechanismus regulace opravné dráhy Fanconiho anémie za pomoci fosforylace proteinu FANCI. Za tímto účelem byly vytvořeny fosfomimetické mutanty tohoto proteinu, s jejichž pomocí byla sledována vazba na DNA. Hlavním cílem této diplomové práce bylo odhalit jak fosforylace proteinu FANCI ovlivňuje jeho vazbu na DNA, a to s i bez přítomnosti jeho vazebného partnera FANCD2. Fosfomimetické mutace na určitých fosforylačních místech byly zkoumány a porovnány v DNA vazebných testech a také za pomoci anizotropie fluorescence. Vliv fosforylace FANCI na monoubiquitinylaci FANCD2 byl zkoumán pomocí...
|
|
| |
host ::
RSS.